希少シングルセルのロスレス処理
細胞を失うことなくシングルセルを分離、染色し、希少細胞を二度と失うことはありません。
SIEVEWELL ™チップにより、新世代のナノウェルアレイが利用可能になりました。SIEVEWELL ™は、液体チャンバーのベースに追加のナノウェル構造を持つチャンバースライドの新しいデザインです。これらの個々のナノウェルのそれぞれは、ウェルの底に2つの微細孔を持ち、その下の小さな液体ギャップに接続されています。これにより、ナノウェル内の細胞を捕捉し、液体チャンバーの上部から細孔を通って下の液体ギャップに一方向の流れを生成することができます。この設計のおかげで、シングル細胞を分離してナノウェル内で捕捉するだけでなく、細胞を失うことなく、抗体の標識、染色、洗浄など、これらのウェル内で直接処理することも可能になりました。この完全にセルロスのないオンチップ処理により、SIEVEWELL™が実現します。 循環腫瘍細胞、胎児細胞などの分離など、希少なシングル細胞アプリケーションに非常に魅力的な技術です。 CellCelector™テクノロジーと組み合わせたチップ設計により、シングル細胞の識別を完全に自動化し、目的の標的細胞を100%純粋に分離することができます。
SIEVEWELL™: 技術的な詳細と機能
デザイン
- 一般的なスライドガラスと同サイズ
- 生体適合性、非細胞毒性材料を使用しているため細胞毒性なし
- チップ内での固定、透過、染色、洗浄が可能
- 超低接着表面処理済み
- シングルセルに合わせた幅20 µm、深さ25 µmのナノウェル構造。効率的なシングル細胞の捕捉に最適です。
- チップあたりのナノウェル数 370,000(17 x 17mm)
- ナノウェルの六角形の形状は、自動化された細胞検出と細胞カウントに理想的です。
- 各ナノウェルの底面に2個のミクロ穴(直径2µm)があり、細胞を効率的に保持しながら液体を簡単に通過させます。
SIEVEWELL™メンブレンの上面図
SIEVEWELL™メンブレンの側面図
SIEVEWELL™メンブレンの明視野画像。ナノウェルの底にある細孔がよく見えます。
SIEVEWELL™メンブレンの光学特性
- 明視野顕微鏡中の高い透明度
- 非常に低い自家蛍光シグナル
これにより、SIEVEWELL ™テクノロジーは顕微鏡および光学測定に非常に適しており、高品質の顕微鏡画像データの取得が可能になります。
SIEVEWELL™: の仕組み
SIEVEWLL™の370,000個のナノウェルの底部には2個の貫通孔があります。貫通孔の大きさは細胞より小さいため、チャンバー内のバッファー・培地のみが貫通孔を通過し、細胞はナノウェルの底面に保持されます。細胞の懸濁液をチャンバーにロードした後にサイドポートからバッファーを吸引すると、細胞はバッファーの流れによってナノウェルに格納されます。細胞はナノウェルに保持されるため、細胞を失うことなく染色や洗浄が可能です。
細胞懸濁液をチップにロードした後、標準のピペットで液体を吸引することにより、内部液体チャンバーからサイドポートへの一方向の流体の流れを生成および制御できます。細胞は液体の流れに従い、ナノウェルに閉じ込められます。細胞がナノウェルに入ると、それはミクロポアをブロックするため、そのナノウェルを通る液体の流れが減少します。したがって、他のセルは自動的に他の空のナノウェルにリダイレクトされ、自己選別型ナノウェルアレイになります。細胞ローディングに続いて、オンチップ染色は、固定、透過処理、ブロッキング、インキュベーション、および洗浄中に細胞を失うことなく、同じ方法で実行できます。
SIEVEWELL™ を用いたオンチップ染色を備えたワークフロー
ステップ1細胞懸濁液をロード
ステップ2細胞の染色と洗浄
ステップ3目的細胞の検出
ステップ4シングル細胞のピッキング
ステップ5ダウンストリーム解析
1.セルローディング
濃縮または処理されたシングル細胞懸濁液をチップにロードします。SIEVEWELL ™テクノロジーは、生細胞および固定細胞と互換性があります。
ステップ1
SIEVEWELL™ に細胞懸濁液をロードします。細胞はナノウェルに格納されます。生細胞でも固定済みの細胞でも使用可能です。
ステップ2
SIEVEWELL ™チップのサイドポートからバッファーを吸引します。試薬を添加して、細胞の固定や透過処理、抗体や各種染色での染色、洗浄を行います。
ピペットで吸引することにより、方向性のある流れが内部チャンバーから、各単一ナノウェルの底にある2つの微細孔を通って、サイドポートのピペットに向かって生成されます。
細胞は液体の流れとともに下に移動し、細胞が通過するのを防ぐのに十分小さい微細孔のためにナノウェル内に閉じ込められます。
ナノウェルは細胞を1つ捕捉するサイズです。細胞がナノウェルに入りますと、細胞はその細孔を塞ぎ、このウェルを通るメディウムの流れを減少させます。その結果、他の細胞は周囲の空のナノウェルに自動的にリダイレクトされ、非常に高い効率の自己シングル細胞補足性能をもたらします。
SIEVEWELL™にロードされたA549細胞
2.細胞の染色と洗浄
試薬を追加し、インキュベートして洗浄し、細胞を失うことなく染色します。染色前のデバイス内固定も可能です。
ステップ1
試薬または洗浄液は、SIEVEWELL ™チップのチャンバーに添加されます。
右:洗浄前の蛍光画像
ステップ2
過剰な試薬または洗浄バッファーは、SIEVEWELL ™チップのサイドポートから吸引されます。細胞はナノウェル内に閉じ込められているため、プロセス中に失われることはありません。
右:洗浄後の蛍光画像
3.細胞の検出
チップはCellCelector™でスキャンされ、標的細胞が検出されます。細胞はナノウェルに保持されており、スキャン前後でも元の位置は変わりません。
SIEVEWELL™ チップは平坦性が高いため、焦点を失うことなくチップの全領域を簡単にスキャンできます。
CellCelector™でスキャン
青:DAPI; 緑:A549細胞; 赤:凍結細胞
ナノウェルに捕捉されたCTC
4. 細胞の回収
特定したターゲットの細胞はPCRチューブまたは細胞培養プレートに移されます。SIEVEWELL™ チップはシングル細胞ピッキングシステムALS CellCelector™ でチューブや培養プレートなどに回収します。
ALS CellCelector™ を使用したシングルセルの回収
分配先ウェル内の分離されたA549細胞
5.ダウンストリーム分析
SIEVEWELL™ 技術は回収したシングル細胞のDNA次世代シーケンス、RNAシーケンスなどの一般的な分子生物学的分析が可能です。 また、生細胞を回収し、培養することも可能です。
シングル細胞RT-PCRは、GAPDHの遺伝子特異的プライマーを使用して実行されました。
PC:ポジティブコントロール、プールされたA549細胞からのc-DNA
NC:ネガティブコントロール、溶解バッファー
関連する参考文献
- Ladurner M. et al. Validation of Cell-Free RNA and Circulating Tumor Cells for Molecular Marker Analysis in Metastatic Prostate Cancer Biomedicines. 2021 Aug 12;9(8):1004
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