細胞株の開発

製薬細胞株開発のための単一細胞クローニングの革命はここにあります

細胞培養プレートの大きなスタックに数千の細胞を播種して、それらが単一の細胞ではなく、生存可能または生産的でないことを確認するのにうんざりしていませんか？すべてを備え、プロジェクトの力価目標を達成する1つのクローンについて、何百ものプレートをスクリーニングするのにうんざりしていませんか？なぜあなたの製薬細胞株の開発を偶然に任せるのですか？CellCelector™シングルセルおよびコロニーピッキングプラットフォームを使用すると、クローンを効果的に評価および検証してから、選択するクローンを決定できます。1週間以内に、単一細胞のプールから、モノクローナルで実行可能で生産的であることが証明されたクローンでいっぱいのプレートに到達します。勝者を生み出すために大量のプレートに頼る代わりに、クローンの将来を確実に予測する実際のデータを使用できるようになりました。これにより、消耗品とメディアのコストが劇的に節約されます。

統合された単クローン性の証明と生存率アッセイを備えた1ラウンドの単一細胞クローニングワークフロー

CellCelector™ はハイスループットのシングル細胞クローニングに使用できるようになり、クローン医薬品生産セルラインの高速生成が可能になりました。クローンは、堅牢なインプロセスの画像検証済みモノクローン性を担保しながら、1回のクローン作成ラウンドで生成されます（HT-NIC法はHigh Throughput Nanowell based Image verified Cloningの略です）

この統合された単一クローン性とクローンの生存率評価、および96または384ウェルプレートへのクローン移入後の業界をリードする成長率により、CellCelector™シングルセルクローニングテクノロジーは、シングルセルクローニングアプローチの次世代を表しています。そのため、従来の方法をはるかに超えており、限界希釈、FACSソーティング、またはシングルセル印刷技術に代わる優れた方法を提供します。この特許出願中の方法は、ProBioGenAGおよび他のCellCelector™ のお客様と共同で開発および検証されています。

CellCelector™ nanowell cell culture plates

HT-NIC法はCellCelector™ ナノウェルプレートに基づいています（ALSから入手可能）。これらのプレートは、各ウェルの底に数千の小さなナノウェルを備えた24ウェルおよび6ウェルの細胞培養プレートとして利用できます。プレートの種類に応じて、これらはウェルあたり4,300〜22,000ナノウェル、またはプレートあたり100,000〜130,000ナノウェルという数になります。ナノウェル内にある細胞は、互いに効率的に分離されます。しかし、それらは同じ培地で覆われているため、互いに分離されておらず、細胞の効果的な共培養につながります。プール内のすべての細胞は、それらの単クローン性を維持しながら、細胞株の増殖に貢献します。これにより、細胞株の増殖が非常に困難な場合でも、業界をリードする単一細胞の増殖率が得られます。

CellCelector™ ナノウェルベースの単一細胞クローニングワークフロー

細胞播種は、従来の細胞培養プレートと同様の方法で実行されます。細胞を播種した後、古典的なポアソン分布に従って、ナノウェル内にランダムに捕捉されます。シードされたウェルの自動スキャンと、それに続くシングル細胞を含むすべてのナノウェルの自動識別により、堅牢で文書化された画像ベースのモノクローン性の証明が提供されます。播種された細胞の数に応じて、ウェルごとに400〜600個のシングル細胞が捕捉され、分析できます。複数のウェルを播種することで、1つの細胞を含む最大14,000ナノウェルから始めることができます-これらは全て1つのナノウェルプレート内にあります。

Nanowell-based single cell cloning workflow

モノクローン性が記録された後、細胞はインキュベーター内で3〜6日成長し、クローンあたり最大20〜75個の細胞になります。従来のメチルセルロースベースのアプローチとは異なり、CellCelectorナノウェルベースの方法では、液体培地でコロニーを成長させることができます。クローンは同じメディアを共有していますが、ナノウェルの壁によって互いに効果的に分離されています。細胞がシングル細胞クローンに成長した後、ナノウェルプレートが再度スキャンされ、モノクローナルの生存可能なクローンが自動的に選択され、さらなる分析とアップスケーリングのために96または384ウェルプレートに移されます。

自動化されたモノクローナル性の証明：ナノウェルでの堅牢なシングル細胞検出

従来のシングル細胞クローニングワークフローでは、シングル細胞が96 ウェルプレートに播種されるため、細胞はウェルの端に定着することが多く、明視野での信頼性の高い自動単一細胞検出は困難です。したがって、0日目の特定のクローンのモノクローン性状態は、通常、クローンが成長した後、手動または遡及的にチェックされます。しかし、なぜ細胞が占める表面の100倍を超えるウェル領域内の単一の細胞を検索するのでしょうか。CellCelector™ではHT-NICアプローチセルは分離され、200 µm以下の大きなナノウェルでもはっきりと観測できます。　さらに播種直後やナノウェルの境界に触れたときでもソフトウェアによって確実かつ自動的に識別できます。

Monoclonality assessment: single cell detection in nanowells

CellCelector™は100％のモノクローン性を提供します

シングル細胞クローニングのよく知られた伝統的な方法である限界希釈は、ポアソン分布に従ってウェルごとに播種された細胞の平均数に依存し、モノクローン性の統計的確率にのみ基づいています。ポリクローナルウェルの割合を制限するために、播種は通常、ウェルあたり0.2個以下の細胞で行われます。残念ながら、モノクローナルであるウェルは約16 ％にすぎません（つまり、プレートの8分の7が空のままです）。したがって、400個のシングルセルウェルを取得できるようにするには、25枚以上の96ウェルプレートに播種する必要があります。非モノクローナルウェルの大幅な増加を犠牲にして、0.5細胞/ウェルを播種することにより、単一細胞ウェルの数を2倍にすることが可能です。

シングル細胞ナノウェルの自動識別、クローンへの増殖の追跡、および増殖したクローンの96 ウェルプレートへのクロスコンタミネーションのない回収により、CellCelector™ HT-NICクローニング法はナノウェルプレートへの播種に使用されるサンプル調製、細胞タイプ、または細胞密度に関係なく、100％モノクローナルウェルを提供します。

CellCelector™でモノクローナルウェルを取得する効率をナノウェルベースのクローニング方法と、2つの播種密度で使用される限界希釈法との比較。

限界希釈法を用いて400個のモノクローナルウェルを取得するには、0.2細胞/ウェルまたは0.5細胞/ウェルの播種密度で26または1396ウェルプレートを使用する必要があります。同じ数の単一細胞ナノウェルに到達するには、CellCelector™ナノウェルプレートで1つのウェルだけで十分です。

実行可能なシングルセルクローンの割合を最も高くする

限界希釈法を改善すると、播種されたウェルのわずか10 ％から20 ％になり、シングル細胞から増殖した生存可能なクローンが得られます。FACSシングルセルソーティングやシングルセルプリンターなどの他の従来の方法では、ウェルに播種された単一細胞の割合がはるかに高くなります。通常、フローサイトメトリーに関連する高せん断応力と、沈着したシングル細胞がそれ自体で大量の培地に存在するという事実は、30 ％から64 ％の割合で不確実な増殖を引き起こします。また、これには外部成長因子を含む特殊で高価なクローニング培地が必要であり、シングル細胞からは成長しない、成長が困難な細胞株には適していません。

しかしながら、CellCelector™ のHT-NIC法では、すべての播種細胞は同じ培地を共有しすべての播種細胞は同じ培地を共有し、クローン性を損なうことなく天然の成長因子を放出することにより、互いの成長に貢献します。クローンがモノクローナルで生存可能であることが証明された後にのみ、クローンが選択され、96ウェルプレートに静かに移されます。これは、転送される単一の細胞ではなく、実行可能でモノクローナルの小さなクローンであるため、大きなウェルで成長し続けます。

サンプル間の汚染を排除する使い捨て消耗品

ALSは手頃な価格の使い捨てCellCelector™ガラスキャピラリーおよびナノウェルプレートを提供します。クローニング実験の間のクロスコンタミネーションを防止します。1枚のガラスキャピラリーと1枚のナノウェルプレート（または後者の数ウェル）で、クローントランスファーに使用する目的のマイクロプレートの数に制限されることなく、シングル細胞のクローニング実験を実行できます。

使用済みのキャピラリーは、後で再使用するために、実験後にシステム内の設備によって自動的に濯がれ、滅菌が行われます。

制御された無菌環境での信頼性の高いシングルセルクローニング

無菌状態でアッセイとクローントランスファーを実行するために、CellCelector™システムをバイオセーフティキャビネット内に配置することができます。これは、ALSがシステムと一緒に提供する標準のフードまたはカスタマイズされたボックスにすることができます。細胞の生存率とアッセイの安定性をさらに向上させるために、CellCelector™をALS Incubator FlowBox™にインストールすることもできます。ALS Incubator FlowBox™ は、コンパクトな層流細胞培養フードと温度、湿度、CO2制御、および滅菌用のUVランプを組み合わせたものです。