Picken von Hybridoma & CHO Klonen aus halbfesten Medien
Screening und Isolierung von hoch exprimierenden Klonen für die Antikörperproduktion
Ein fundamentaler Schritt in der Entwicklung neuer Zelllinien für die Antikörperproduktion ist die Identifikation von Einzelzellklonen, die dauerhaft eine hohe Produktion des Zielproteins aufweisen. Verglichen mit den zeit- und arbeitsaufwändigen konventionellen Methoden ist das Produktivitätsscreening mit dem CellCelector™ wesentlich effizienter.
Selektion und Isolierung von Klonen mit der höchsten Produktivität
Die Antikörperproduktion von Hybridomaklonen kann sich enorm von Klon zu Klon unterscheiden. Die von den Klonen generierten und in das Medium sekretierten Proteine können durch Fluoreszenz-gekoppelte sekundäre Antikörper sichtbar gemacht werden. Da die Viskosität des halbfesten Mediums die Diffusion der sekretierten Proteine einschränkt, erscheint das Signal als fluoreszierenden Lichtschein um den jeweiligen Klon herum. Um speziell die Klone zu selektieren, die die größte Produktivität aufweisen vergleicht die CellCelector™ Software die Größe des im Durchlicht sichtbaren Klons mit der Größe des im Fluoreszenzlicht sichtbaren Lichtkreises und kalkuliert daraus einen Faktor der die Antikörperproduktivität jedes Klons angibt. Daraus lässt sich ein Ranking aller Klone erstellen, auch über mehrere Platten hinweg, so dass der Klon mit der besten Antikörperproduktion identifiziert werden kann.
Schematische Ansicht von Hybridomaklonen (hellblau) und die Detektion der sekretierten Antikörper (dunkelblau) durch fluoreszenz-markierten Sekundärantikörper (grün mit gelbem Kreis)(A-C).
Mikroskopische Ansicht (Überlagerung von Durchlicht und Fluoreszenzlicht) von Hybridomaklonen nach der Inkubation mit fluoreszenz-markierten Sekundärantikörper (D-F).
Die Intensität der Antikörperproduktion korreliert mit dem Durchmesser des den Klon umringenden fluoreszierenden Lichtkreises: Der Klon produziert keine Antikörper (A und D), der Klon produziert mittlere Mengen an Antikörpern (B und E), der Klon produziert viel Antikörper = Hochproduzent (C und F). Die Größe der Klone ist vergleichbar (siehe das vergrößerte Feld in den Durchlichtbildern D-F).
Antikörperproduzierender CHO Zellklon; QC Bild vor und nach dem Picken mit dem Methylzellulosemodul des CellCelector™
CHO Zellklon, der mit dem Methylzellulosemodul isoliert und in eine 96-Well Zielplatte überführt wurde (an Tag 1 und Tag 5 nach der Überführung).
Vorteile des monoklonalen Koloniepickens aus Methylzellulose oder anderen halbfesten Medien mit dem CellCelector™
Hochauflösende Optik und intelligentes Imaging-System
- Detektion kleiner Kolonien oder einzelner Zellen nahe großer Klone, so dass die Monoklonalität des Zielklons sichergestellt werden kann.
- Die Struktur der Kolonien kann analysiert und morphologische Filter (wie Sphärizität und Form) können definiert werden, um auffällige (z.B. längliche) Kolonien vom Picken auszuschließen.
- Vor und nach dem Picken aufgenommene Mikroskopiebilder sowie Live-Bilder während des Pickens erlauben eine Qualitätskontrolle.
Kundenspezifische Anpassung und Flexibilität
- Bis zu 6 Fluoreszenzkanäle; Filtersets können an die Anforderungen der Anwendung angepasst werden.
- Standardformate und kundenspezifische Formate für Ausgangs- und Zielplatte möglich.
- Integration in vor- und nachgelagerte automatisierte Prozesse möglich.
- Langzeitexperimente möglich durch die Installation in unsere Incubator FlowBox
Verwendung von Einwegspitzen
- Keine Kreuzkontaminationen oder Verstopfen der Spitzen durch die Verwendung austauschbarer Einweg-Plastikspitzen, welche zwischen den einzelnen Picks automatisch gewechselt werden.
- Keine Waschschritte für die Spitzendekontamination notwendig.
- Verschiedene Spitzengrößen für verschiedene Klongrößen verfügbar.
Besonderheiten
- Detektion der am besten bewerteten Klone aus einem Stapel an Platten: Erst werden alle Platten gescannt und dann erfolgt das Picken Platte für Platte.
- Kontrollierte kleine Aufsaugvolumen und Geschwindigkeiten verhindern das gleichzeitige Picken der Nachbarklone.
- Die automatische Verifizierung von Bewegungen der Nachbarklone während des Pickens stellt sicher, dass alle Zielklone vor dem Picken automatisch zentriert werden.
- Automatisierte Analyse der Klonumgebung vor dem Picken verhindert das Picken von Klonen, die zu nah an anderen Klonen liegen.
- Nutzerdefinierte Sortierungsstrategie zur Erstellung einer Rangliste, z.B. Sortierung nach Klonqualität, Klongröße oder Klonproduktivität.
WEITERFÜHRENDE PUBLIKATIONEN
- Zoldan, K. et al. Automated clonal selection of high-producing hybridoma colonies from methylcellulose-based, semi-solid medium using the cell separation robot CellCelectorTM nature methods application notes (2010)
- Caron A.W. et al. Fluorescent labeling in semi-solid medium for selection of mammalian cells secreting high-levels of recombinant proteins (CHO) BMC Biotechnol. 9: 42 (2009)
- Julien, A. et al. Antigen specific antibody-producing clones selected by isotypes Biosystems International Application Note
- Gilbert, R. Fluorescent labeling in Semi-Solid Medium to Identify High Expressing Clones for Recombinant Protein Production (CHO) CHI's Bioprocessing Summit Presentation, Boston 2011
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