Isolierung von Spermien
Automatisierte Isolierung einzelner Spermien mit dem ALS CellCelector™
Die Isolierung einzelner Spermazellen ist wichtig für die Erstellung von genetischen Fingerabdrücken zur Klärung von Fragen zu familiären Beziehungen, für die Gerichtsmedizin zur Aufdeckung von Sexualdelikten sowie für In-vitro-Fertilisationsverfahren.
Hier beschreiben wir die Isolierung einzelner Spermazellen mit dem ALS CellCelector™.
Die einzigartige Kombination von hochpräziser Robotertechnologie mit inverser Mikroskopie ermöglicht die automatische Erkennung sowie die Isolierung einzelner Spermien mit Hilfe von Glaskapillaren. Zeitaufwändige Handarbeit kann durch standardisierte Bedingungen bei Verwendung des CellCelectors™ ersetzt werden.
Einzelne Spermien wurden unter Hellfeldbeleuchtung mit einem 20x-Objektiv beobachtet und isoliert.
Mithilfe spezieller Softwarefunktionen zur mikroskopischen Vermessung von Objekten wurde die Größe der Spermienauf ca. 5 x 33 µm bestimmt.
Zur besseren Ansicht ist der rechteckige markierte Bereich vergrößert dargestellt (unten rechts).
Detektion einzelner Spermazellen
Die Erkennung einzelner Spermien kann entweder im manuellen Modus durch Mausklick auf den Live-Bildschirm oder automatisch mit einem Satz angepasster Erkennungsparameter (Durchmesser, Fläche, Elongation usw.) nach dem Scannen der Probe erfolgen.
Die grundlegende Erkennung erfolgt durch die Definition eines Grauwertbereichs. Die Zielzellen können von den Nachbarzellen und vom Hintergrund unterschieden werden.
Je nach Einstellung der Grauwertschwellen wurden entweder gesamte einzelne Spermien oder nur die Köpfe der Spermien erkannt.
Set-up von Parametern für die automatisierte Detektion einzelner menschlicher Spermazellen.
Unterschiedliche Grauwertbereiche (A & B) ermöglichen die Erkennung verschiedener Teile der Spermien (D & E, erkannte Bereiche grün markiert) auf der Grundlage des Referenzbildes (C).
Die Berücksichtigung zusätzlicher Parameter wie Durchmesser, Fläche, Dehnung (F), kann das Scan-Ergebnis noch weiter verbessern (G & H).
Isolierung einzelner Spermien
Zur Isolierung einzelner Spermien wurden Borosilikatglaskapillaren mit einem Innendurchmesser von 30 µm verwendet. Durch die Ausbildung eines Ansaugdrucks direkt über der Zelle unter Verwendung eines Flüssigkeitsvolumens von 60 nl wurde die Zelle vom Boden gelöst und mit der Flüssigkeit in die Glaskapillare gesaugt. Die isolierten Samenzellen wurden in separate Vertiefungen von 2x8-Well-Ibidi-Objektträgern transferiert. Jede einzelne Zellisolierung wurde automatisch durch Bilder dokumentiert, die vor und nach dem Entnahmeprozess aufgenommen und in Datenbanken gespeichert wurden.
Mikroskopische Bildaufnahmen vor (links) und nach (rechts) der Isolierung der einzelnen Spermienzelle.
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